Filtrácia TFF s tangenciálnym prietokom v kombinácii s ultracentrifugáciou na efektívnu prípravu malých extracelulárnych vezikúl

Malé extracelulárne vezikuly (sEV) sú vezikuly nanometrov vylučované bunkami, ktoré obsahujú nukleové kyseliny, proteíny, malé molekuly a ďalšie zložky a hrajú dôležitú úlohu v medzibunkovej komunikácii. Malé extracelulárne vezikuly -typu exozómov majú veľkú podobnosť so svojimi rodičovskými bunkami. V porovnaní s umelými nanočasticami vykazujú nižšiu mieru imunitného klírensu a nižšiu cytotoxicitu, čo z nich robí sľubných kandidátov ako novýchin vivo nosiče na dodávanie liečiv. Takmer všetky typy buniek môžu vylučovať tieto vezikuly a výskum ich aplikácie ako nosičov liekov sa postupne presúva z laboratória ku klinickým aplikáciám. všakveľká{0}}výroba zostáva hlavnou prekážkou.

 

Súčasné metódy izolácie extracelulárnych vezikúl

Súčasné metódy izolácie extracelulárnych vezikúl zahŕňajúultracentrifugácia, centrifugácia s hustotným gradientom, veľkostná -vylučovacia chromatografia (SEC) a zrážanie polyetylénglykolom (PEG).

Precipitácia PEG ponúka vysoký výťažok a jednoduchú prevádzku, ale je spojená s významnou kontamináciou nežiaducimi proteínmi. Centrifugácia s hustotným gradientom a veľkostná-vylučovacia chromatografia môžu poskytnúť produkty s vysokou-čistotou, ale ich účinnosť je relatívne nízka a procesy sú časovo-náročné. Ultracentrifugácia je široko používaná, ale jej objem spracovania je obmedzený kapacitou odstredivky, čo sťažuje jej zväčšenie.

 

Aplikácia tangenciálnej prietokovej filtrácie na separáciu sEV

Tangenciálna prietoková filtrácia (TFF) už bola aplikovaná na separáciu nanočastíc, ako sú lipozómy a lentivírusové vektory. V TFF prúdi krmivo tangenciálne cez povrch membrány, čo pomáha znižovať zanášanie membrány a uľahčuje proces zväčšovania.

Keďže malé extracelulárne vezikuly sa vo všeobecnosti pohybujú od30-200 nmv priemere, a0,45 μm membránová kazetamožno vybrať v systéme TFF na odstránenie väčších proteínov a vezikúl, zatiaľ čo a300 kDa membránová kazetamožno použiť na odstránenie proteínov s nízkou molekulovou hmotnosťou-a koncentrovanie malých extracelulárnych vezikúl prítomných v kultivačnom médiu.

 

Charakterizácia suroviny po separácii TFF

Analýza sledovania nanočastíc (NTA) ukázala, že priemery častíc boli distribuované hlavne v rozsahu0-250 nm.

 

 

Transmisná elektrónová mikroskopia (TEM) však odhalila veľké množstvo kontaminujúceho proteínu, pričom neboli pozorované žiadne extracelulárne vezikuly. Tieto výsledky naznačujú, že na ďalšiu purifikáciu extracelulárnych vezikúl bol potrebný ďalší purifikačný krok.

 

Charakterizácia TFF koncentrátu po 100 kDa ultrafiltrácii

TFF koncentrát bol ďalej spracovaný s použitím a100 kDa ultrafiltračná trubica.

NTA ukázala, že priemery častíc v koncentrátoch získaných po jednom a dvoch kolách ultrafiltrácie zostali hlavne v rozmedzí0-250 nm. Avšak uskutočnenie ultrafiltrácie dvakrát viedlo k významnému zníženiu počtu získaných častíc.

Analýza TEM ukázala, že neboli pozorované žiadne štruktúry podobné vezikulám v jedno-ani dvoj{2}} ultrafiltračných koncentrátoch, pričom zostalo značné množstvo kontaminujúceho proteínu.

preto100 kDa ultrafiltrácia nemohla byť účinne použitá na čistenie kultivačného média po koncentrácii TFF.

 

 

Charakterizácia TFF koncentrátu purifikovaného ultracentrifugáciou

NTA ukázala, že priemery častíc purifikovaných produktov boli distribuované hlavne v rozmedzí0-250 nm.

Dôležité je, že TEM jasne odhalila štruktúry podobné vezikulám{0}}v rôznych zorných poliach. Tieto výsledky ukázali, že po zahustení kultivačného média pomocou TFF,ultracentrifugácia môže byť následne použitá na ďalšiu separáciu a purifikáciu extracelulárnych vezikúl.

 

 

Charakterizácia sEV izolovaných z média upraveného mezenchymálnymi kmeňovými bunkami pomocou TFF v kombinácii s ultracentrifugáciou

NTA ukázala, že priemery častíc purifikovaných produktov boli distribuované hlavne v rozmedzí0-250 nm.

Vezikulárne-štruktúry boli pozorované pomocou TEM. Analýza Western blot preukázala pozitívnu expresiu proteínov spojených s extracelulárnymi vezikulami -CD9, CD63 a ALIXv purifikovaných extracelulárnych vezikulách.

Tieto výsledky potvrdili, že purifikované malé extracelulárne vezikuly obsahovali exozómy, čo naznačuje, že túto metódu možno použiť aj naizolácia a extrakcia exozómov.

 

 

Záver: TFF v kombinácii s ultracentrifugáciou pre vysoko{0}}kvalitnú prípravu sEV

Štúdia to preukázalaSamotná koncentrácia TFFvýsledkom bol produkt obsahujúci značné množstvo kontaminujúcich proteínov, a preto nepostačoval na získanie kvalifikovaných extracelulárnych vezikúl.

Podobne pomocou a100 kDa ultrafiltračná skúmavka na sekundárne čistenieneposkytli účinne neporušené štruktúry vezikúl.

Kombináciou koncentrácie TFF s následnou ultracentrifugačnou purifikáciou je možné integrovať výhody oboch techníkvysokokvalitné-produkty z malých extracelulárnych vezikúl.

V porovnaní so samotnou bežnou ultracentrifugáciou môže kombinovaný proces efektívneznížiť celkový čas spracovania a zlepšiť účinnosť separácie.

V tomto pracovnom postupeTFF umožňuje rýchle obohatenie-veľkoobjemových vzoriek, ktorý sa zaoberá obmedzením konvenčnej ultracentrifugácie pri spracovaní veľkých objemov vzoriek. Ultracentrifugácia potom vykoná hĺbkové čistenie, aby sa odstránili spolu{1}}koncentrované proteínové nečistoty a zároveň pomáha zachovať čistotu a integritu vezikúl.

Okrem toho proces nevyžaduje pridávanieexogénne chemické zrážacie činidlápomáha zachovať biologickú aktivitu vezikúl v čo najväčšej miere.

Z hľadiska priemyselného prekladu je tento proces významnýzvýšiť-potenciála môže pomôcť pri riešení problémov spojených s-rozsiahlou produkciou extracelulárnych vezikúl predodávanie liekov, regeneratívna medicína a súvisiaci vývoj produktov. Poskytuje tiež solídny experimentálny základ pre následnú optimalizáciu procesov a pilotnú-výrobu.

 

Odkaz

Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha a kol.Zavedenie spôsobu separácie malých extracelulárnych vezikúl filtráciou s tangenciálnym tokom v kombinácii s ultracentrifugáciou. Chinese Journal of Biologicals, 2022, 35 (9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.